Анализ на коронавирус методом ифа

Имунно-ферментный анализ

Иммуноферментный анализ в ветеринарной клинике представляет собой вид ветеринарного лабораторного исследования, в основу которого положена иммунологическая реакция по типу «антиген-антитело». Своё название иммуноферментный анализ получил благодаря использованию ферментативной метки, которая вводится в один из компонентов иммунологической реакции.

При взаимодействии специфического антитела с антигеном происходит активация фермента, и количество образованных продуктов цветной (ферментативной) реакции, (интенсивность их окрашивания), позволяет оценить количество антигенов или антител во взятом для исследования материале. Таким образом, иммуноферментный анализ позволяет провести качественную и количественную диагностику определённой инфекции.

Ветеринарный иммуноферментный анализ отличается высокой специфичностью и разнообразием используемых тест-систем. Для данного вида исследования в качестве материала используется плазма или сыворотка венозной крови кошки, собаки или другого животного.

Чаще всего иммуноферментный анализ применяется для выявления в крови антител, которые вырабатываются иммунной системой животного в ответ на попадание в организм антигенов возбудителей различных заболеваний. Однако при помощи данного метода исследования можно выявлять и антигены возбудителей всевозможных инфекции в данной биологической жидкости.

Метод иммуноферментного анализа используется для диагностики различных заболеваний вирусной и бактериальной природы, для выявления антител, определения уровня гормонов и для нахождения маркеров онкологии.

Специфичность и чувствительность данного ветеринарного лабораторного метода оценивается  в 90% — 100%.

Выявление методом иммуноферментного анализа антигена возбудителя того или иного заболевания, в отличие от вирусологических и бактериологических методов исследования, не зависит от его жизнеспособности. То есть антигены будут найдены при помощи тест-систем ИФА и в том случае, если возбудитель продолжает свою жизнедеятельность, и тогда, когда в результате лечения или за счёт внутренних резервов организма возбудитель был обезврежен.

Вместе с тем отрицательный результат при выявлении антител к антигенам возбудителя той или иной инфекции не может быть гарантией того, что животное здорово, так как иммунный ответ формируется в течение определённого времени, что и определяет рекомендации проводить иммуноферментный анализ в динамике, как минимум дважды через временной промежуток, составляющий две-три недели.

Нельзя забывать и о том, что возможны ситуации получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов, поскольку выявление иммуноглобулинов свидетельствует о наличии антител к возбудителю заболевания, а не о присутствии в организме самого возбудителя.

Посредством специальных тест-систем иммуноферментного анализа можно выявлять как антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов, так и проводить количественный анализ иммуноглобулинов определённого класса.

Среди неоспоримых преимуществ данного метода диагностики широкий спектр выявляемых с его помощью инфекций, быстрота проведения лабораторного исследования; относительная простота методики; возможность осуществления объективной оценки силы иммунного ответа организма на антигены возбудителя, установление фазы инфекционного процесса, отслеживание динамики иммунного ответа.

Что такое иммуноглобулины и как они связаны с COVID-19

Иммуноглобулины (Ig) — это специфические белки, которые выделяются клетками иммунной системы в ответ на присутствие патогенов. Основными функциями иммуноглобулинов являются:

• Связывание с антигенами возбудителя.
• Нейтрализация возбудителя.
• Привлечение других «компонентов» иммунной системы для подавления чужеродных агентов.

Выделяют несколько классов иммуноглобулинов, но если говорить о коронавирусной инфекции (и других заболеваниях), то наиболее интересными являются два из них — IgG и IgM.

Иммуноглобулины класса М первыми вырабатываются в ответ на проникновение в организм того или иного возбудителя

Поэтому определение данных антител играет важное значение в диагностике острой стадии заболевания, когда патоген присутствует в организме

Иммуноглобулины класса G обеспечивают дальнейшую защиту от повторного проникновения возбудителя. Их максимальная концентрация отмечается примерно через три недели после заражения COVID-19.

Таким образом, IgM говорят о наличии острой инфекции, а IgG помогают подтвердить тот факт, что человек уже переболел.

Каждый желающий может протестироваться на COVID-19 в «ПрофМедЛаб». Вы можете вызвать нашего специалиста для проведения анализа на дом, а также заключить с клиникой договор на проведение тестирования у сотрудников от имени юридического лица.В «ПрофМедЛаб» выполнено уже более 30000 анализов на коронавирусную инфекцию.

Расшифровка теста IgM/IgG

Поскольку наиболее информативными при респираторных вирусных инфекциях являются иммуноглобулины М и G, то чаще всего акцент делается именно на эти антитела. Тест IgM/IgG проводится методом ИХА. Это качественный анализ, который показывает статус иммуноглобулинов M и G в крови.

В таблице 1 мы приводит результаты расшифровки такого теста. Знаками «+» и «-» обозначается наличие или отсутствие иммуноглобулина при тестировании.

Из всех 4-х вариантов только один (IgG (-),IgM (-)) указывает на возможное отсутствие контакта с вирусом SARS-CoV-2. Однако причины у такого результата могут быть и другие:

• Пренебрежение правилами подготовки к анализу. Методики ИФА и ИХА отличаются высокой чувствительностью. Несоблюдение правил подготовки к такому анализу может исказить результат.
• Отсутствие антител после болезни. В ряде случаев, когда ковид проходит в легкой форме, антитела могут не обнаруживаться.
• Антитела к интерферону. Примерно у 10% людей с тяжелой формой COVID-19 вырабатываются антитела к интерферону. Последний представляет собой систему противовирусных белков, которые вырабатываются при инфицировании. Так вирусу SARS-CoV-2 удается обезоружить иммунную систему пациента, лишив ее интерфероновой защиты. При таких обстоятельствах иммуноглобулины к вирусным антигенам быстро исчезают.

Наконец, если у вас характерные для коронавирусной болезни симптомы, то это не всегда COVID-19. Грипп и простудные заболевания никуда не исчезли, и люди продолжают ими болеть.

Комбинации результатов тестов на коронавирус разными методами

Может говорить об острой фазе инфекции COVID-19; не дает информации о наличие или отсутствие у пациента коронавируса; не дает информации, является ли он потенциальным распространителем вируса или нет. 

Требуется проведение теста методом ПЦР.

Рекомендована самоизоляция на 2 недели.

Может говорить о поздней фазе инфекции.

Требуется повторить анализ через 2-4 недели.

Может говорить об острой фазе инфекции COVID-19 с выделением вируса и возможностью стать источником потенциального заражения.

Требуется консультация врача и самоизоляция на 2 недели.

Свидетельствует о факте контакта с вирусом в прошлом с формированием специфического иммунного ответа. Вероятность повторного заражения существенно снижена (наличие устойчивого иммунитета к коронавирусу пока не доказано). Вероятность выделения вируса минимальная. Дополнительные обследования при отсутствие симптомов не требуются.  

Рекомендовано продолжать соблюдение социального дистанцирования и мер предосторожности, так как на сегодняшний день не накоплено достаточно данных, позволяющих полностью исключить возможность повторного заражения. 

Свидетельствует о факте контакта с вирусом в прошлом с формированием специфического иммунного ответа. Вероятность повторного заражения существенно снижена (наличие устойчивого иммунитета к коронавирусу пока не доказано). Вероятность выделения вируса минимальная. Дополнительные обследования при отсутствие симптомов не требуются.  

Рекомендовано продолжать соблюдение социального дистанцирования и мер предосторожности, так как на сегодняшний день не накоплено достаточно данных, позволяющих полностью исключить возможность повторного заражения. 

Нет данных о контакте этого человека с коронавирусом. При наличие симптомов рекомендовано дополнительно сдать анализ методом ПЦР, а также повторить анализ на IgM и IgG антитела через 2-4 недели

В ЕС-Клинике вы можете пройти ПЦР-диагностику, экспресс-тестирование за 15 минут методом ИХА или сдать кровь на анализ на антитела методом ИФА. Мы проводим все виды тестирования на коронавирус и антитела IgG, IgM к SARS-COV-2 (COVID-19) для физических и юридических лиц. Берем анализ в клинике или с выездом на дом, в офис, на предприятие. Заявки принимаем круглосуточно по телефону +7(499)4500303

Преимущества ИФА-анализа

• Выявление болезней до возникновения симптомов, а также инфекций, имеющих скрытую вялотекущую и атипичную форму.
• Высокая чувствительность, выявляющая концентрацию антител до 0,05 нг/мл. Это позволяет обнаружить возбудителей, находящихся в организме в малых концентрациях.
• Простота проведения реакции и её автоматизация, дающие возможность получить результаты в достаточно короткий срок.
• С помощью ИФА-диагностики можно не только выявить инфекцию, но и определить примерный срок заражения, а также её тип течения (острая, хроническая).
• ИФА-анализ с высокой достоверностью выявляет микроорганизмы, которые не диагностируются при помощи микроскопии, посевов и некоторых других методов.
• Возможность проведения количественного анализа, показывающего концентрацию антител. По этому показателю можно судить о степени инфицированности и периоде болезни.

Сочетание двух методов обследований ИФА и ПЦР (обнаружение микроорганизмов по фрагментам их генного материала) дает возможность с практически 100% точностью определить все имеющиеся инфекции. Такое сочетание позволяет минимально сократить «период окна», во время которого возбудитель уже находится в организме, а ИФА-анализ отрицательный, поскольку еще не успели выработаться антитела.

Анализы на инфекции

ИФА-анализы на различные инфекции можно пройти в «Университетской клинике». Исследования проводятся с применением новых технологий и реактивов, что позволяет добиться их высочайшей точности.

Комбинированные тесты

Цель комбинированных тестов, как и вестерн-блоттинга, — определить ВИЧ-статус человека.

Они представляют собой тот же анализ ИФА, но усовершенствованный — «два в одном». Тест позволяет определить не только человеческие антитела к вирусу ВИЧ, но и вирусный антиген — белок p24. Из этого белка состоит внутренняя оболочка вируса — нуклеокапсид, о котором мы говорили выше.

Комбинированные тесты на ВИЧ тоже бывают «домашними» и лабораторными.

●        Пример «домашнего» комбинированного экспресс-теста — анализ Alere HIV Combo. Этот анализ можно сделать по крови из пальца (по сыворотке тоже, но годится и «простая» кровь), а результаты известны уже через 20 минут.

●        Пример лабораторного комбинированного теста — HIV Ag/Ab Combo, который делают в частных лабораториях за деньги.

Что важно знать об этом тесте? Этот анализ относится к четвертому поколению. На сегодняшний день во всем мире именно он считается оптимальным способом выявления инфекции, потому что недорог и позволяет относительно рано узнать ВИЧ-статус клиента

Если речь идет об определении ВИЧ-статуса, то в Европе и США чаще всего прибегают именно к комбинированным тестам. Если тест дает положительный результат, нет необходимости проводить подтверждающий анализ, его просто через некоторое время сдают повторно — и это считается достаточно надежным.

Дело в том, что антиген — вирусный белок р24 — появляется в крови уже в первую неделю после заражения, то есть задолго до того, как вырабатываются антитела. Поскольку комбинированный тест определяет антиген, шанс узнать свой статус есть уже через 21—28 дней после предполагаемого инфицирования.

После того как начинают вырабатываться антитела, вирусный белок р24 из крови пропадает. Иногда это происходит уже на вторую неделю, но у 90—95 % инфицированных людей антитела появляются в крови в первые три месяца после заражения.

Предсказать, когда именно появятся антитела, невозможно, ведь организм каждого человека по-своему реагирует на вирус ВИЧ. Но даже если антиген р24 из крови успеет исчезнуть, комбинированный тест найдет если не р24, то как минимум антитела, и все равно даст верный ответ.

Диагностика вирусов и бактерий картофеля методом ИФА

Иммуноферментный анализ (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный метод качественного и количественного определения разнообразных молекул, вирусов, бактерий и т.п. В основе метода лежит высокоспецифичная иммунологическая реакция антитела и антигена.

Антителами являются сложные белковые молекулы (иммуноглобулины), синтезируемые клетками иммунной системы человека и прочих теплокровных животных в ответ на проникновение в организм антигенов – вирусов, бактерий, молекул и прочих чужеродных объектов. Высокая специфичность взаимодействия между антителом и антигеном обусловлена тем, что активный центр антитела способен связываться с уникальным фрагментом антигена.  Именно это свойство реакции антитело-антиген определяет специфичность, надёжность, достоверность и чувствительность ИФА при проведении диагностики патогенов картофеля. При наличии целевого патогена в исследуемом образце формируется комплекс соответствующих антител и антигена, детекцию которого определяют по активности фермента, связанного с антителами.

Существует широкое разнообразие методов  проведения ИФА, различающихся природой антигена, принципом связывания, условиями проведения, способами детекции результатов ферментативной реакции и т.п. Для диагностики патогенов сельскохозяйственных культур традиционно используется “сэндвич”-метод с использованием двух типов антител (DAS-ELISA – double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). В качестве фермента, обычно, используется щелочная фосфатаза.

Проведение иммуноферментного анализа

Реакция проводится в 96-луночных полистирольных микропланшетах, характеризующихся высокой эффективностью связывания белковых молекул, в т.ч. иммуноглобулинов (антител), на своей поверхности.

На первом этапе антитела захвата (capture antobodies) разводят в необходимой концентрации в покровном буфере (coating buffer), вносят в лунки микропланшетов и инкубируют от нескольких часов при температуре +30-37°С до нескольких дней при температуре +4°С. Во время инкубирования антитела неспецифически адсорбируются на поверхности лунок микропланшета. По окончании инкубирования планшеты промывают несколько раз промывочным буфером (wash buffer) для удаления антител захвата, которые не связались с поверхностью микропланшета.

Сорбция антител захвата на поверхности лунки микропланшета

На следующем этапе в лунки микропланшета, поверхность которых покрыта антителами захвата, вносят сок, экстракт, или гомогенат растений, исследуемых на наличие антигенов – патогенных бактерий или вирусов и инкубируют 14-16 часов  при температуре +4°С. При необходимости, растительный материал можно развести экстракционным буфером (extraction buffer). По окончании инкубирования лунки несколько раз промывают промывочным буфером.

При наличии целевого патогена в образце происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антигенсвязывающим центром антител захвата.

Связывание антигена с антителами захвата

В промытые лунки наносят антитела детекции, конъюгированные с ферментом щелочная фосфатаза (Ф). Антитела разводят в необходимой концентрации в конъюгатном буфере (conugation buffer). Микропланшеты инкубируют при температуре +30°С в течение 5 часов. По окончании инкубирования микропланшеты несколько раз промывают промывочным буфером для удаления антител детекции, не связавшихся с антигенами.

На данном этапе происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антиегнсвязывающим центром антител детекции. Антигенсвязывающие центры антител захвата и антител детекции различны и специфично связываются с разными фрагментами антигена.

Связывание антител детекции с антигеном

На заключительном этапе в лунки добавляют пара-нитрофенилфосфат, являющийся субстратом для фермента щелочная фосфатаза. При наличии в растительном образце целевых патогенов формируется комплекс антитело захвата-антиген (вирус или бактерия)-антитело детекции, конъюгированное с ферментом щелочная фосфатаза. Фермент (Ф) катализирует превращение бесцветного пара-нитрофенилфосфата (субстрат, С) в жёлтый пара-нитрофенол (продукт, П), в результате чего происходит окрашивание реакционной смеси в жёлтый цвет. Интенсивность окраски  реакционной смеси можно оценивать как визуально, так и с помощью спектрофотометра.

Фермент, конъюгированный с антителами детекции, катализирует реакцию превращения бесцветного субстрата в жёлтый продукт

Сфера применения

ИФА используют в таких диагностических целях:

• диагностика вирусных инфекций (гепатиты, герпес, ВИЧ-инфекция и др.);
• передающиеся половым путем инфекции (гонорея, хламидиоз, уреаплазмоз и т.п.);
• сифилис;
• онкомаркеры;
• диагностика аллергии, а также иммунодефицитных состояний.

Что значит ИФА-анализ и как он проводится

Суть этого исследования – обнаружение в сыворотке крови и измерение концентрации антител (иммуноглобулинов, Ig). Эти соединения выделяются организмом в ответ на попадание антигенов – чужеродных белков, принадлежащих возбудителям инфекции.

При проведении анализа методом ИФА в сыворотку крови добавляют реактивы, содержащие «меченые» антигены. Эти компоненты «ищут» антитела–иммуноглобулины, выработанные организмом в ответ на имеющуюся инфекцию, и соединяются с ними. Такая реакция называется антиген-антитело.

То есть это исследование ищет не самих возбудителей, а вещества, образовавшиеся из-за их вторжения. Поскольку белки антигенов, входящие в состав реактивов, метят определённым образом, их соединения с иммуноглобулинами можно обнаружить лабораторным путем. При выявлении в образце сыворотки крови комплексов антиген-антитело ИФА-анализ считается положительным.

Лабораторные исследования

Применяемые реактивы «настроены» на конкретных возбудителей. Это дает возможность устранить ложноположительные тесты, указывающие на несуществующее заражение.

Исследования дают возможность выявить примерный период заражения, а также определить характер и тяжесть болезни. С помощью этого метода также определяют содержание каждого из иммуноглобулинов или их общую (суммарную) концентрацию, которая меняется в зависимости от периода и тяжести заболевания.

В разные периоды болезни выделяется несколько видов антител (иммуноглобулинов, Ig):

• IgM – образуются в острую фазу болезни, т.е. примерно через 2 недели после инфицирования. Затем их уровень постепенно падает.
• IgA – появляются в разгар инфекционного процесса. По мере выздоровления их содержание уменьшается. Если уровень IgA в ходе лечения не снижается, велика вероятность, что болезнь перешла в хроническую форму.
• IgG – выявляются на этапе выздоровления. Они могут долго обнаруживаться в организме даже после полного излечения. В некоторых случаях такие иммуноглобулины остаются в организме пожизненно. В такой ситуации ИФА крови показывает не имеющуюся, а когда-то перенесенную инфекцию.

Обнаружение IgM и IgG указывает на обострение хронического инфекционного процесса, поэтому считается неблагоприятным признаком.

Стоимость исследования

Клиника «ПрофМедЛаб» предлагает несколько видов тестов на антитела к COVID-19:

• Количественное определение иммуноглобулинов класса G. Анализ позволяет понять, переболел ли человек коронавирусной инфекцией или нет. Материал для исследования — венозная кровь. Сроки — 24 часа.
• Количественное определение иммуноглобулинов класса G и М. Мы рекомендуем сочетать его с ПЦР с целью получения максимально объективной информации. Материал для исследования — венозная кровь. Сроки — 2–3 дня.
• Экспресс тест SARS-CoV-2 Antibody Test. Можно провести самостоятельно в домашних условиях или у нас в клинике, после чего проконсультироваться с врачом. Материал для исследования — капиллярная кровь (из пальца). Результат будет готов через 20 минут.

Срок готовности исследования — от 1 дня с момента забора материала. Цены на эти и другие виды анализов представлены в таблице:

Источники

1. Eissmann, Philipp. «Natural Killer Cells». British Society for Immunology. British Society for Immunology. Retrieved 8 November 2018.
2. Geisberger R, Lamers M, Achatz G. The riddle of the dual expression of IgM and IgD. Immunology. 2006 Aug;118(4):429-37. doi: 10.1111/j.1365-2567.2006.02386.x. PMID: 16895553; PMCID: PMC1782314.
3. Underdown BJ, Schiff JM. Immunoglobulin A: strategic defense initiative at the mucosal surface. Annu Rev Immunol. 1986;4:389-417. doi: 10.1146/annurev.iy.04.040186.002133. PMID: 3518747.
4. Dorigatti, I., Lavezzo, E., Manuto, L. et al. SARS-CoV-2 antibody dynamics and transmission from community-wide serological testing in the Italian municipality of Vo’. Nat Commun 12, 4383 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-24622-7.