Что такое днк и рнк в биологии?

Выделение фенол-хлороформом

Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статьях с 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот в большинстве исследовательских лабораторий.

Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в определенных пропорциях и последующем перемешивании и центрифугировании смеси.

При выделении нуклеиновых кислот из сложных исходных образцов, таких как кровь или ткани, включают в себя лизис биологического материала детергентами или хаотропными агентами иногда в присутствии разрушающих белки ферментов. После этого этапа следуют несколько стадий, в которых используются органические растворители, такие как Фенол/Хлороформ или Тризолом с последующим осаждением в Изопропиловом спирте. Полное отделение белков от нуклеиновых кислот может быть достигнуто добавлением перхлората натрия.

При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы: водная и органическая, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК. Дополнительно можно попробовать селективное инкубирование с хлоридом лития или специфичное безнуклеазное изолирование с гуанидин хлоридом или гуанидин тиоцианатом, скомбинированное с фенольной экстракцией или этанольной преципитацией. Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях.

Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени.

Состав ДНК

Если говорить о составе ДНК более подробно, то нуклеотиды – это базовый структурный элемент, кирпичики, из которых состоят обе цепи спирали. Нуклеотиды подразделяются на 4 разновидности: аденин, тимин, гуанин и цитозин. И всего четыре этих нуклеотида осуществляют запись всей наследственной информации и составляют все известные гены.

Закручиваются в спираль обе цепочки генов тоже не просто так. Из всех четырех различных нуклеотидов находиться напротив друг друга в разных цепочках они могут только двумя парами: аденин-тимин и гуанин-цитозин. В науке эти пары называются комплементарными.

Между парными нуклеотидами возникает крепкая водородная связь. При этом связь аденином и тимином немного слабее, чем между гуанином и цитозином. Но закручиваются цепочки в спираль по иным причинам:

• Исследования показали, что скручивание помогает сократить длину цепочки генов в 5-6 раз. А во время суперспирализации (такое тоже бывает) длина цепочки может сократиться в целых 30 раз!

• Помимо того, что пара цепочек генов закручена в спираль, существует и суперспирализация. За это явление отвечают гистоновые белки, которые имеют форму катушек для ниток. Уже закрученная двойная спираль наматывается на эти белки, как нитка. Что не оставляет сомнений в том, что спиральность как таковая специально служит тому, чтобы более компактно упаковать наследственную информацию в клетку.

Ферментативное температурно-зависимое выделение

Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

Клинический образец помещается в пробирку с лизирующим буфером, затем подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение НК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а надосадочная жидкость (супернатант), содержащая ДНК, используется для проведения ПЦР.

Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

Основные понятия

Нуклеиновые кислоты — фосфорсодержащие биополимеры, построенные из мономеров — нуклеотидов и обеспечивающие хранение и передачу наследственной (генетической) информации в живых организмах.

■ Открыты Ф. Мишером (1869 г., Швейцария).

* В молекулах нуклеиновых кислот содержится от 80 до нескольких сот миллионов нуклеотидов.

■ Нуклеиновые кислоты содержатся в ядрах, митохондриях и пластидах клеток.

Нуклеотид — органическое соединение, в состав которого входят: одно из пяти азотистых оснований (аденин, гуанин, урацил, тмин, цитозин), пятиуглеродный моносахарид (рибоза или дезокснрибоза) и остаток молекулы фосфорной кислоты (РO₄).

• Название и обозначение нуклеотидов: нуклеотид называется по имени своего азотистого основания и обозначается первой заглавной буквой его названия (пример: А — адениновый нуклеотид).

Комплементарные нуклеотиды — это пары нуклеотидов А и Т, а также Г и Ц, между азотистыми основаниями которых могут образовываться водородные связи.

В зависимости от того, какой сахар входит в состав нуклеотидов, нуклеиновые кислоты подразделяются на дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК).

Что делает ДНК?

ДНК помогает вашему организму расти

ДНК содержит указания, необходимые организму – например, вам, птице или растению – для роста, развития и размножения. Эти инструкции хранятся в последовательности пар нуклеотидных оснований. 

Ваши клетки читают этот код из трех оснований, чтобы генерировать белки, необходимые для роста и выживания. Последовательность ДНК, в которой содержится информация для получения белка, называется геном. 

Каждая группа из трех основ отвечает специфическим аминокислотам, которые являются строительными блоками белков. Например, групы оснований TGG задают аминокислоту триптофан, тогда как основные групы GGC задают аминокислоту глицин.           

Некоторые комбинации, такие как TAA, TAG и TGA, также указывают на конец последовательности белка. Это говорит клетке не добавлять больше белка до аминокислот. 

Белки состоят из различных комбинаций аминокислот. Если их разместить вместе в правильном порядке, каждый белок имеет уникальную структуру и функционирование внутри вашего тела. 

Как перейти от кода ДНК к белку? Что такое РНК? 

Пока мы узнали, что ДНК содержит код, который дает клетке информацию о том, как производить белки. Но что происходит между ними? Проще говоря, это происходит с помощью двухэтапного процесса:  

Во-первых, две цепи ДНК разделились. Затем специальные белки внутри ядра считывают пары оснований на цепочке ДНК, чтобы создать промежуточную молекулу мессенджера.  

Этот процесс называется транскрипцией, а созданная молекула называется месенджерным РНК (мРНК). мРНК – это еще один тип нуклеиновых кислот, и он делает именно то, что следует из названия. Он путешествует вне ядра, служа сообщением для клеточной машины, строит белки.  

На втором этапе специализированные компоненты клетки читают сообщения мРНК одновременно трех пар оснований и работают над сбором белка, аминокислоты за аминокислотой. Этот процесс называется переводом.  

РНК (рибонуклеиновая кислота)

РНК (рибонуклеиновая кислота), так же как и ДНК, относится к нуклеиновым кислотам. Молекулы-полимеры РНК намного меньше, чем у ДНК. Однако в зависимости от типа РНК количество входящих в них нуклеотидов-мономеров различается.

В состав нуклеотида РНК в качестве сахара входит рибоза, в качестве азотистого основания — аденит, гуанин, урацил, цитозин.

Урацил по строению и химическим свойствам близок к тимину, который обычен для ДНК. В зрелых молекулах РНК многие азотистые основания модифицированы, поэтому в реальности разновидностей азотистых оснований в составе РНК намного больше.

Рибоза в отличие от дезоксирибозы имеет дополнительную -ОН-группу (гидроксильную). Это обстоятельство позволяет РНК легче вступать в химические реакции.

Главной функцией РНК в клетках живых организмов можно назвать реализацию генетической информации.

Именно благодаря разным типам рибонуклеиновой кислоты генетический код считывается (транскрибируется) с ДНК, после чего на его основе синтезируются полипептиды (происходит трансляция). Итак, если ДНК в основном отвечает за хранение и передачу из поколения в поколение генетической информации (основной процесс – репликация), то РНК реализует эту информацию (процессы транскрипции и трансляции).

При этом транскрипция происходит на ДНК, так что этот процесс относится к обоим типам нуклеиновых кислот и тогда с этой точки зрения можно сказать, что и ДНК отвечает за реализацию генетической информации.

При более подробном рассмотрении функции РНК намного разнообразнее. Ряд молекул РНК выполняют структурную, каталитическую и другие функции.

Существует так называемая гипотеза РНК-мира, согласно которой вначале в живой природе в качестве носителя генетической информации выступали только молекулы РНК, при этом другие молекулы РНК катализировали различные реакции.

Данная гипотеза подтверждена рядом опытов, показывающих возможную эволюцию РНК. На это указывает и то, что ряд вирусов в качестве нуклеиновой кислоты, хранящей генетическую информацию, имеют молекулу РНК.

Согласно гипотезе РНК-мира ДНК появилась позже в процессе естественного отбора как более устойчивая молекула, что важно для хранения генетической информации. Выделяют три основных типа РНК (кроме них есть и другие): матричная (она же информационная), рибосомальная и транспортная

Выделяют три основных типа РНК (кроме них есть и другие): матричная (она же информационная), рибосомальная и транспортная.

Обозначаются они соответственно иРНК (или мРНК), рРНК, тРНК.

Методы выделения нуклеиновых кислот

Практически все научные исследования в области молекулярной биологии на той или иной стадии включают этап выделения нуклеиновых кислот. Выделенные нуклеиновые кислоты затем используют в ПЦР (ОТ-ПЦР), секвенировании и для множества других задач, причем технологии выделения различаются не только по принципу своего действия, но и в зависимости от типа биоматериала и последующего применения экстракта.

Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. Рассмотрим самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

СУТЬ ПЦР ТЕСТА

Полимеразная цепная реакция или ПЦР – это метод амплификации определенного фрагмента интересующего участка ДНК. Для получения истинного результата предполагается, что нуклеотидная последовательность исследуемой ДНК ИЗВЕСТНА. На основе последовательностей синтезируются короткие одноцепочечные фрагменты ДНК или праймеры на основе принципа комплементарности. Во время амплификации исследуемый участок ДНК расщепляется на две одиночные нити, и обе нити синтезируются обратно в двойные нити на основе связанных с ними праймеров. В результате из одного сегмента ДНК получаются две идентичные нити ДНК. Циклы повторяются, и количество исследуемых участков ДНК увеличивается в геометрической прогрессии. Следовательно, ПЦР может дать миллионы и миллиарды копий небольшого количества образцов ДНК за короткий период времени.

Благодаря быстродействию, простоте использования и чувствительности этот метод получил широкое распространение в различных областях, в том числе при обнаружении инфекционных заболеваний. В случае РНК-вирусов, таких как коронавирус, к методу добавляется дополнительный этап синтеза – обратная транскриптаза, где, согласно принципу комплементарности, вирусная РНК сначала получается из ДНК, которая затем амплифицируется с помощью ПЦР. Результат часто отслеживается в режиме реального времени, и это изменение в ПЦР-анализе называется rRT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени или (real time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction).

Однако ни один метод не является безупречным и требует дополнительной проверки и калибровки. Праймеры для ПЦР специфичны для участков, и можно утверждать, что праймеры, разработанные для участка X, не могут размножать участок Y. Затем, при разработке каждого конкретного протокола ПЦР, существует несколько химико-физических и других параметров, которые определяют результат анализа. Случайные мутации во время тестирования, возможность перекрестного заражения , человеческого фактора и т. д. также играют важную роль.

Модель ДНК Уотсона-Крика

Б 1953 г. Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик, основываясь на данных рентгеноструктурного анализа кристаллов ДНК, пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух полимерных цепей, образующих двойную спираль (рисунок 3).

Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей (рисунок 3). При этом аденин образует пару только с тимином,  а  гуанин — с цитозином. Пара оснований  А—Т  стабилизируется двумя водородными связями,  а  пара G—С — тремя.

Длина двухцепочечной ДНК обычно измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов (п.н.). Для молекул ДНК, состоящих из тысяч или миллионов пар нуклеотидов, приняты единицы т.п.н. и м.п.н. соответственно. Например, ДНК хромосомы 1 человека представляет собой одну двойную спираль длиной 263 м.п.н.

Сахарофосфатный остов молекулы, который состоит из фосфатных групп и дезоксирибозных остатков, соединенных 5’—З’-фосфодиэфирными связями, образует «боковины винтовой лестницы»,  а  пары оснований  А—Т  и G—С — ее ступеньки (рисунок 3).

Рисунок 3: Модель ДНК Уотсона-Крика

Цепи молекулы ДНК антипараллельны: одна из них имеет направление 3’→5′, другая 5’→3′. В соответствии с принципом комплементарности, если в одной из цепей имеется нуклеотидная последовательность 5-TAGGCAT-3′, то в комплементарной цепи в этом месте должна находиться последовательность 3′-ATCCGTA-5′. В этом случае двухцепочечная форма будет выглядеть следующим образом:

• 5′-TAGGCAT-3′
• 3-ATCCGTA-5′.

В такой записи 5′-конец верхней цепи всегда располагают слева,  а  3′-конец — справа.

Носитель генетической информации должен удовлетворять двум основным требованиям: воспроизводиться (реплицироваться) с высокой точностью и детерминировать (кодировать) синтез белковых молекул.

Модель ДНК Уотсона—Крика полностью отвечает этим требованиям, так как:

• согласно принципу комплементарности каждая цепь ДНК может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Следовательно, после одного раунда репликации образуются две дочерние молекулы, каждая из которых имеет такую же нуклеотидную последовательность, как исходная молекула ДНК.
• нуклеотидная последовательность структурного гена однозначно задает аминокислотную последовательность кодируемого ею белка.

Четвертичная структура

Четвертичная структура нуклеиновых кислот аналогична четвертичной структуре белка . Хотя некоторые концепции не совсем совпадают, четвертичная структура относится к более высокому уровню организации нуклеиновых кислот. Более того, это относится к взаимодействиям нуклеиновых кислот с другими молекулами. Наиболее часто встречающаяся форма высокоуровневой организации нуклеиновых кислот проявляется в форме хроматина, который приводит к его взаимодействиям с гистонами малых белков . Также четвертичная структура относится к взаимодействиям между отдельными единицами РНК в рибосоме или сплайсосоме .

Разработки наборов для выделения нашей компании.

На данный момент в нашей компании ВМТ разрабатываются наборы для пробоподготовки на основе всех трех подходов к экстракции НК:

• Набор на основе сорбционной экстракции. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
• Набор на основе спиртового осаждения. Эту надежную, проверенную, хорошо работающую методику, нашедшую широкое применение в клинической практике мы адаптировали для выделения геномной ДНК из цельной крови и сыворотки.
• Набор для выделения нуклеиновых кислот методом сорбции на silica-spin колонках – наиболее интересная и перспективная разработка.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК): строение

Роль хранителя наследственной информации у всех клеток — животных и растительных — принадлежит ДНК.

Схема строения ДНК изображена на рисунке 74. Молекула ДНК представляет собой две спирально закрученные одна вокруг другой нити.

Ширина такой двойной спирали ДНК невелика, около 2 нм. Длина же ее в десятки тысяч раз больше — она достигает сотен тысяч нанометров.

Между тем самые крупные белковые молекулы в развернутом виде достигают в длину не более 100 — 200 нм.

Таким образом, вдоль молекулы ДНК могут быть уложены одна за другой тысячи белковых молекул.

Молекулярная масса ДНК соответственно исключительно велика — она достигает десятков и даже сотен миллионов.

Обратимся к структуре ДНК. Каждая нить ДНК представляет собой полимер, мономерами которого являются нуклеотиды.

Нуклеотид — это химическое соединение остатков трех веществ: азотистого основания, углевода (моносахарида — дезоксирибозы) и фосфорной кислоты.

ДНК всего органического мира образованы соединением четырех видов нуклеотидов. Их структуры приведены на рисунке рисунке 75.

Как видно, у всех четырех нуклеотидов углевод и фосфорная кислота одинаковы.

Нуклеотиды отличаются только по азотистым основаниям, в соответствии с которыми их называют; нуклеотид с азотистым основанием аденин (сокращенно А), нуклеотид с гуанином (Г), нуклеотид с тимином (Т) и нуклеотид с цитозином (Ц).

По размерам А равен Г, а Т равен Ц; размеры А и Г несколько больше, чем Т и Ц.

Соединение нуклеотидов в нити ДНК происходит через углевод одного нуклеотида и фосфорную кислоту соседнего. Они соединяются прочной ковалентной связью — рисунок 76.

Итак, каждая нить ДНК представляет собой полинуклеотид. Это длинная цепь, в которой в строго определенном порядке расположены нуклеотиды.

Рассмотрим теперь, как располагаются относительно друг друга нити ДНК, когда образуется двойная спираль, и какие силы удерживают их рядом.

Представление об этом дает рисунок рисунок 77, на котором изображен небольшой участок двойной спирали.

Как видно, азотистые основания одной цепи «стыкуются» с азотистыми основаниями другой. Основания подходят друг к другу настолько близко, что между ними возникают водородные связи.

В расположении стыкующихся нуклеотидов имеется важная закономерность, а именно: против А одной цепи всегда оказывается Т на другой цепи, а против Г одной цепи — всегда Ц.

Оказывается, что только при таком сочетании нуклеотидов обеспечивается, во-первых, одинаковое по всей длине двойной спирали расстояние между цепями и, во-вторых, образование между противолежащими основаниями максимального числа водородных связей (три водородные связи между Г и Ц и две водородные связи между А и Т).

В каждом из этих сочетаний оба нуклеотида как бы дополняют друг друга. Слово «дополнение» на латинском языке «комплемент». Принято поэтому говорить, что Г является комплементарным Ц, а Т комплементарен А.

Если на каком-нибудь участке одной цепи ДНК один за другим следуют нуклеотиды А, Г, Ц, Т, А, Ц, Ц, то на противолежащем участке другой цепи окажутся комплементарные им Т, Ц, Г, А, Т, Г, Г.

Таким образом, если известен порядок следования нуклеотидов в одной цепи, то по принципу комплементарности сразу же выясняется порядок нуклеотидов в другой цепи.

Большое число водородных связей обеспечивает прочное соединение нитей ДНК, что придает молекуле устойчивость и в то же время сохраняет ее подвижность: под влиянием фермента дезоксирибонуклеазы она легко раскручивается.

ДНК содержится в ядре клетки, а также в митохондриях и хлоропластах.

В ядре ДНК входит в состав хромосом, где она находится в соединении с белками.

Виды нуклеотидов

В природе существует два вида нуклеиновых кислот — рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеиновые (ДНК). Основанием каждой из них является азотистое основание, остаток фосфорной кислоты и пятиуглеродный сахар.

В состав ДНК входит четыре разновидности нуклеотидов, отличие которых заключается в азотистом соединении:

• А — аденин;
• Т — тимин;
• Ц — цитозин;
• Г — гуанин.

Что касается РНК, то они тоже имеют несколько видов в зависимости от азотистого основания:

• У — урацилом;
• Ц — цитозин;
• Г — гуанин;
• А — аденин.

Поговорим и о физических свойствах нуклеотидов. Они легко растворяются в воде, но при этом практически нерастворимы в растворителях, имеющих органическое происхождение. Очень восприимчивы к температурным перепадам, а также критическим показателям значения уровня рН.

Структура и отличие от ДНК

РНК и ДНК в сравнении

По структуре РНК похожа на ДНК . В отличие от двухцепочечной ДНК, молекулы РНК обычно одноцепочечные, но могут образовывать характерные рефолдинги на коротких отрезках с комплементарными последовательностями оснований (AU, GC), которые внутримолекулярно создают впечатление двухцепочечной спирали. Оба являются полинуклеотидами, в которых азотистые основания сахаров связаны друг с другом через диэфиры фосфорной кислоты . Одноцепочечность увеличивает количество возможностей для трехмерных структур в РНК и позволяет ей подвергаться химическим реакциям, которые ДНК не может. Каждый нуклеотид в РНК состоит из рибозы (то есть пентозы : сахара с пятью атомами углерода), фосфатного остатка и органического основания . Рибоза РНК идентична рибозе ДНК, за исключением гидроксильной группы вместо атома водорода в положении 2 ‘ в пентозном кольце (отсюда также дезоксирибонуклеиновая кислота, D NA). Это различие делает РНК менее стабильной по сравнению с ДНК, поскольку она обеспечивает гидролиз с помощью оснований: группа ОН в положении 2 ‘сахара лишена протона из-за отрицательно заряженного гидроксид-иона, а оставшийся кислород лишен своего протона. протонная кольцевая связь с фосфором, в результате чего связь со следующим нуклеотидом разрывается. РНК разбита на нуклеотиды.

В РНК входят следующие органические основания : аденин , гуанин , цитозин и урацил . Первые три основания также встречаются в ДНК. Урацил, с другой стороны, заменяет тимин в качестве дополнительного основания к аденину. Предположительно, РНК использует урацил, потому что он менее энергичен для производства (без метильного замещения).

Структуры шпильки, стержневой петли и петли известны как в РНК , но также возможна конформация спирали, при которой структуры шпильки и петли имеют как одноцепочечные, так и двухцепочечные области. Петлевые структуры обозначают одноцепочечные петлевые структуры внутри молекулы.

Подобно ДНК, РНК также может присутствовать в виде двухцепочечной молекулы. Он имеет типичные черты спирали Уотсона-Крика: антипараллельное расположение нитей РНК и правосторонняя спираль. Он принимает форму спирали A или A ‘(см. ДНК ). A-РНК также обозначается как РНК-11, гомологичная A’-РНК, которая обозначается как РНК-12. Число после тире указывает количество пар оснований на один виток спирали. A´-РНК часто встречается при высоких концентрациях соли (более 20%).

A-РНК: 11 пар оснований на оборот спирали, шаг от 2,7 нм до 2,8 нм, угол наклона к оси спирали примерно 14 °
A’-РНК: 12 пар оснований на оборот спирали, шаг 3 нм, угол наклона к оси спирали. ось спирали от 16 ° до 19 °

Энантиомер РНК, обнаруженный в живых существах, — это D- РНК. Он состоит из D- рибонуклеотидов. В центрах хиральности находятся в D- рибозы. Используя L- рибозу или L- рибонуклеотиден, можно синтезировать L- РНК. Это сравнительно более стабильно по сравнению с ферментативной деградацией РНКазами .

Третичная структура

Нуклеиновые кислоты также могут принимать сложные пространственные структуры: тРНК должны иметь правильную третичную структуру для своей функции.